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Confocal माइक्रोस्कोप एक प्रकार के विशेष ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप को संदर्भित करता है जो ऑप्टिकल स्लाइस रिकॉर्ड कर सकता है।
एक एकल विवर्तन सीमा बिंदु को रोशन और अवलोकन करके, ऑप्टिकल स्लाइसिंग को एक लेजर कन्फोकल सिस्टम में महसूस किया जाता है। इसके लिए आवश्यक है कि दो बीम सेगमेंट में एक ही फोकस हो, इसलिए वे "कन्फोकल" हैं। वाइड-फील्ड छवियों के विपरीत, confocal छवियों में कोई दोष नहीं होता है। यह अपने आप में एक फायदा है, क्योंकि नमूने की गहरी छवि स्पष्ट और विवरण में समृद्ध है। हालांकि, सबसे महत्वपूर्ण लाभ सूक्ष्म सुविधाओं के साथ इसकी त्रि-आयामी विज़ुअलाइज़ेशन क्षमता है। छवि अनुक्रम को Z-Stack के साथ अधिग्रहित करने के बाद, 3D ऑब्जेक्ट को पुनर्निर्माण और कंप्यूटर द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।
- कन्फोकल रोशनी
प्वाइंट लाइट सोर्स रोशनी को एक छोटे एपर्चर (पिनहोल) पर प्रकाश स्रोत पर ध्यान केंद्रित करके और फिर इसे नमूने पर ध्यान केंद्रित करके महसूस किया जाता है। जब एपर्चर काफी छोटा होता है, तो रोशनी बिंदु केवल विवर्तन द्वारा सीमित होता है, न कि प्रकाश स्रोत और एपर्चर के ज्यामितीय मापदंडों द्वारा। साधारण प्रकाश स्रोत एक बड़ा सतह प्रकाश स्रोत है, इसलिए इसे विवर्तन सीमा स्थान पर ध्यान केंद्रित करना असंभव है। इसलिए, हालांकि संप्रेषण बहुत कम है, इस तरह की केंद्रित रोशनी प्रकाश अभी भी बहुत आवश्यक है (पारंपरिक प्रकाश स्रोतों के लिए)।
चित्रा 1: कन्फोकल इमेजिंग के लिए रोशनी। प्रकाश स्रोत (एलएस) से प्रकाश रोशनी पिनहोल (पीआई) पर केंद्रित है और फिर नमूना एस में प्रवेश करता है ..
एक प्रकाश स्रोत के रूप में लेजर में बहुत अधिक संकोच होता है (एक अच्छे लेजर में प्रकाश "बेहद समानांतर" है)। इसलिए, लेजर को एक पिनहोल का उपयोग किए बिना एकल लेंस के माध्यम से एक विवर्तन-सीमित स्थान पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। इसलिए, अधिकांश कन्फोकल माइक्रोस्कोप में कोई रोशनी पिनहोल नहीं है। प्रकाश स्थान की गुणवत्ता लेजर की बीम गुणवत्ता पर निर्भर करती है। यदि गुणवत्ता अच्छी नहीं है, तो आप लाइटिंग पिनहोल भी डाल सकते हैं। लेजर आमतौर पर ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से कन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए युग्मित होता है। ये फाइबर खुद भी पिनहोल के रूप में कार्य करते हैं।
लेजर का फोकलाइज़ेशन और उच्च ऊर्जा घनत्व इसे confocal माइक्रोस्कोप के लिए एक आदर्श प्रकाश स्रोत बनाता है। लेजर का सुसंगतता कन्फोकल प्रदर्शन की एक आवश्यक विशेषता नहीं है। इसके विपरीत, यह ऑप्टिकल डिजाइनरों के लिए एक चुनौती है, क्योंकि यह झूठे हस्तक्षेप पैटर्न का कारण बनेगा, इसलिए सावधानीपूर्वक डिजाइन रणनीतियों की आवश्यकता है।
इसके अलावा, यह तथ्य कि पारंपरिक लेजर केवल एक ही रंग (लेजर- "लाइन") का उत्सर्जन करता है, इसकी अपनी सीमाएं हैं। मल्टी-फ्लुओरेसेंस इमेजिंग और माप में, जटिल मल्टी-लेजर व्यवस्था की आवश्यकता होती है। सफेद लेजर कुशलता से बहु-रंग इमेजिंग की समस्या को हल करता है।
चित्रा 2: कन्फोकल (सही क्षेत्र) और गैर-कॉनफोकल इमेजिंग की तुलना। Feulgen में माउस ट्रोफोब्लास्ट में सना हुआ। गैर-कॉनफोकल छवियों की बहुत सारी जानकारी फोकल प्लेन से नहीं आती है। कन्फोकल ऑप्टिक्स सभी फजी कारकों को समाप्त करता है और संरचना को स्पष्ट करता है।
कन्फोकल डिटेक्शन
अधिकांश डिटेक्टरों में काफी बड़ा संवेदनशील क्षेत्र होता है (फोटोमुल्टिप्लियर ट्यूब आमतौर पर कई वर्ग सेंटीमीटर होते हैं)। कन्फोकल ऑप्टिक्स को पॉइंट सेंसिंग की जरूरत है। इसलिए, लाइट बीम में एक छोटा एपर्चर (पिनहोल) डालकर स्पॉट डिटेक्शन करना आवश्यक है। पिनहोल पर नमूने के प्रकाश को ध्यान केंद्रित करना, प्रेषित प्रकाश को इकट्ठा करना और रिकॉर्ड करना।
क्योंकि विवर्तन पैटर्न संख्यात्मक एपर्चर और तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करता है, पिनहोल का पता लगाना आवश्यक है। इसलिए, जब ये पैरामीटर बदलते हैं, तो पिनहोल आकार को समायोजित किया जाना चाहिए।
जब उद्देश्य लेंस बदलता है (आमतौर पर संख्यात्मक एपर्चर के परिवर्तन के साथ), आधुनिक confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोप स्वचालित रूप से पिनहोल व्यास को उचित रूप से बदल देगा। इसलिए, पिनहोल को आमतौर पर डबल या मल्टी-लेयर एपर्चर के रूप में डिज़ाइन किया गया है।
वास्तव में, पिनहोल का उचित आकार न केवल तरंग दैर्ध्य और संख्यात्मक एपर्चर पर निर्भर करता है, बल्कि माइक्रोस्कोप में ऑप्टिकल तत्वों के आंतरिक आवर्धन पर भी।
इसलिए, यह न केवल अवांछनीय है, बल्कि विभिन्न डिजाइनों के साथ सूक्ष्मदर्शी में पिनहोल व्यास की तुलना करना भी गलत है। यदि पिनहोल व्यास को इष्टतम मान पर सेट नहीं किया गया है, तो सिस्टम ऑप्टिकल स्लाइसिंग को सुचारू रूप से नहीं कर पाएगा (अर्थात, डिफोकस ब्लर को प्रसारित करता है), या आगे ऑप्टिकल स्लाइसिंग गुणवत्ता प्राप्त किए बिना अनावश्यक रूप से तीव्रता को काट दिया (जिसके परिणामस्वरूप अनावश्यक शोर छवियां होती हैं)।
चित्रा 3: कन्फोकल इमेजिंग में पता लगाना। नमूना एस से प्रकाश अवलोकन पिनहोल (पीओ) और फिर डिटेक्टर डी पर केंद्रित है।
कन्फोकल स्कैनिंग का ऑप्टिकल पथ
कन्फोकल स्कैनिंग सिस्टम में कन्फोकल बीम पथ केवल बिंदु स्रोत रोशनी और बिंदु का पता लगाने का संयोजन है। इस संयोजन का उपयोग ऑप्टिकल चाकू के रूप में किया जा सकता है। केवल फोकल विमान से फोटॉन सेंसर को प्रेषित किया जा सकता है। जबकि अन्य स्थानों के सभी फोटॉन को फ़िल्टर किया जाता है। ऑप्टिकल स्लाइसिंग को "स्थानिक फ़िल्टर" के माध्यम से महसूस किया जाता है।
क्योंकि केवल एक ही स्थान एक निश्चित समय में "कन्फोकल" इमेजिंग दिखाई देता है, ग्रिड मोड में ऑब्जेक्ट फ़ील्ड पर स्पॉट को स्थानांतरित करने के लिए एक स्कैनिंग डिवाइस की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, ऑप्टिकल दर्पण स्कैनिंग मोटर पर स्थापित किया जाता है और स्कैनिंग प्रक्रिया को निष्पादित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक पूर्ण फ्रेम (आमतौर पर) 1,024 लाइनों को स्कैन करने के लिए आवश्यक समय में एक अड़चन है। एक हाई-स्पीड स्कैनर (अनुनाद स्कैनर) को पेश करके सुधार प्राप्त किया गया है जो 8, 000 या प्रति सेकंड अधिक लाइनों को स्कैन करता है।
केवल परावर्तित प्रकाश की माइक्रोस्कोप तकनीक के तहत एक अच्छा ऑप्टिकल स्लाइस प्राप्त किया जा सकता है। यह हाल के 20 वर्षों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के जोरदार विकास के कारणों में से एक है (अन्य कारणों में इम्युनोस्टेनिंग, डीएनए- संकरण, फ्लोरोसेंट बायोसेंसर, क्वांटम डॉट्स और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का आविष्कार शामिल है)।
चित्रा 4: बाएं से दाएं: 1। रोशनी शंकु न केवल फोकल विमान में फ्लोरोसेंट डाई को उत्तेजित करती है, बल्कि इसे ऊपर और नीचे भी उत्तेजित करती है। यहाँ एक हरे डबल शंकु द्वारा प्रतिनिधित्व किया गया है। 2। उत्सर्जन पिनहोल प्रभावी रूप से फोकल विमान के ऊपर से उत्सर्जित प्रकाश को रोकता है। 3। इसके अलावा, फोकल प्लेन के नीचे से प्रकाश पिनहोल से नहीं गुजरेगा। 4। कन्फोकल सिस्टम में, नमूने से केवल प्रकाश डिटेक्टर तक पहुंच जाएगा। पिनहोल का पता लगाने से अन्य क्षेत्रों से किसी भी प्रकाश को प्रभावी ढंग से अस्वीकार कर दिया जाएगा। अंत में, वास्तविक ऑप्टिकल अनुभाग प्राप्त किया जाता है।
